فلوسایتومتری چیست؟
فلوسایتومتری (Flow Cytometry) یکی از تکنیکهای پیشرفته آزمایشگاهی برای بررسی سریع ویژگیهای فیزیکی و مولکولی سلولها و ذرات معلق است. در این روش، سلولها بهصورت تکتک از مقابل یک یا چند پرتو لیزر عبور میکنند و اطلاعاتی مانند اندازه سلول، پیچیدگی داخلی و میزان بیان مارکرهای سطحی یا داخلسلولی ثبت میشود. فلوسایتومتری در هماتولوژی، ایمونولوژی، سرطانشناسی، بررسی بیماریهای نقص ایمنی، شمارش سلولها، آنالیز چرخه سلولی، آپوپتوز و تحقیقات زیستی کاربرد گستردهای دارد. در صورتی که دستگاه علاوه بر آنالیز، توانایی جداسازی فیزیکی سلولها را نیز داشته باشد، به آن FACS گفته میشود.
فلوسایتومتری چیست؟
نحوه عملکرد، کاربردها و تفاوت Flow Cytometry با FACS
- فلوسایتومتری برای بررسی سریع سلولها در یک سوسپانسیون استفاده میشود.
- سلولها بهصورت تکتک از مقابل لیزر عبور میکنند.
- اندازه، پیچیدگی داخلی و مارکرهای سلولی قابل بررسی هستند.
- آنتیبادیهای متصل به فلوروکروم برای شناسایی مارکرها استفاده میشوند.
- FACS نوعی فلوسایتومتری است که علاوه بر آنالیز، سلولها را جداسازی میکند.
فلوسایتومتری چیست؟
فلوسایتومتری یک روش آنالیز سلولی است که میتواند هزاران سلول را در هر ثانیه بررسی کند. نمونه باید به شکل سوسپانسیون باشد؛ یعنی سلولها یا ذرات بهصورت جدا از یکدیگر در یک مایع معلق باشند.
هنگامی که سلولها از مقابل پرتو لیزر عبور میکنند، نور به جهات مختلف پراکنده میشود. در صورت استفاده از آنتیبادیهای فلورسنت، فلوروکرومهای متصل به سلول نیز نور را جذب کرده و در طول موج مشخصی منتشر میکنند.
دتکتورهای دستگاه این سیگنالها را ثبت کرده و نرمافزار آنها را به نمودارهایی مانند Histogram و Dot Plot تبدیل میکند.
Flow Cytometry چگونه کار میکند؟
- قرار دادن سلولها در یک جریان باریک
- عبور تکبهتک سلولها
- Hydrodynamic Focusing
- لیزرها
- عدسیها و فیلترها
- دتکتورهای نوری
- تبدیل سیگنال نوری به الکتریکی
- پردازش دادهها
- نمایش Histogram و Dot Plot
سیگنالهای اصلی در فلوسایتومتری
مراحل انجام فلوسایتومتری
اجزای اصلی دستگاه فلوسایتومتر
دستگاه فلوسایتومتر چیست؟
فلوسایتومتر دستگاهی است که سلولهای معلق را با سرعت زیاد آنالیز میکند. دستگاههای ساده ممکن است تنها چند پارامتر را اندازهگیری کنند، در حالی که سیستمهای پیشرفته قادرند بیش از ۲۰ یا حتی ۳۰ مارکر را بهصورت همزمان بررسی کنند.
برخی دستگاهها فقط برای آنالیز طراحی شدهاند و برخی دیگر قابلیت جداسازی سلولها را نیز دارند.
کاربردهای فلوسایتومتری
- ایمونوفنوتایپینگ
- CD3، CD19، CD34، CD45 و MPO
- T Cell
- B Cell
- NK Cell
- نسبت CD4/CD8
- شمارش CD4
- پایش وضعیت ایمنی
- بررسی بیماری باقیمانده
- کاربرد در بدخیمیهای خونی
- G0/G1
- S
- G2/M
- Annexin V
- Propidium Iodide
- سلول زنده، آپوپتوتیک و نکروتیک
- زندهمانی
- درصد جمعیتها
- سلولهای نادر
- بیان پروتئین
- سایتوکاینها
- سلولهای بنیادی
- عملکرد میتوکندری
تفاوت Flow Cytometry و FACS
| ویژگی | Flow Cytometry | FACS |
|---|---|---|
| آنالیز سلول | دارد | دارد |
| جداسازی فیزیکی سلول | ندارد | دارد |
| سرعت بررسی | بالا | بالا |
| پیچیدگی دستگاه | کمتر | بیشتر |
| هزینه | پایینتر | بالاتر |
| کاربرد اصلی | بررسی و شمارش سلولها | بررسی و جداسازی سلولها |
FACS مخفف Fluorescence-Activated Cell Sorting است. هر FACS یک فلوسایتومتر است، اما هر فلوسایتومتر قابلیت FACS ندارد.
تفاوت فلوسایتومتری و ایمونوهیستوشیمی
| ویژگی | فلوسایتومتری | ایمونوهیستوشیمی |
|---|---|---|
| نوع نمونه | سوسپانسیون سلولی | بافت |
| سرعت | بالا | کمتر |
| بررسی همزمان مارکرها | بیشتر | محدودتر |
| اطلاعات ساختار بافت | ندارد | دارد |
| کاربرد | شمارش و ایمونوفنوتایپینگ | مشاهده مارکر در بافت |
فلوروکرومهای رایج در فلوسایتومتری
Compensation و Gating چیست؟
- اصلاح همپوشانی طیف فلوروکرومها
- استفاده از کنترل تکرنگ
- استفاده از Compensation Beads
- انتخاب یک جمعیت سلولی مشخص
- استفاده از FSC و SSC
- بررسی مارکرها در جمعیت انتخابشده
کنترلهای موردنیاز
- تعیین فلورسانس زمینه سلولها
- تنظیم Compensation
- بررسی اتصال غیراختصاصی
- در همه آزمایشها ضروری نیست
- همه فلوروکرومها بهجز یک مورد
- تعیین مرز مثبت و منفی
مزایا و محدودیتهای فلوسایتومتری
- بررسی هزاران سلول در چند ثانیه
- بررسی چندین مارکر بهصورت همزمان
- حساسیت و دقت بالا
- قابلیت شمارش جمعیتهای سلولی
- امکان بررسی سلولهای نادر
- کاربرد گسترده تشخیصی و تحقیقاتی
- هزینه بالای دستگاه و مواد مصرفی
- نیاز به اپراتور باتجربه
- پیچیدگی طراحی پنل آنتیبادی
- نیاز به کنترلهای متعدد
- حساسیت نتایج به کیفیت نمونه
- نبود اطلاعات درباره ساختار بافت
عوامل مؤثر بر کیفیت نتایج
کاربرد فلوسایتومتری در آزمایشگاههای مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| هماتولوژی | تشخیص لوسمی و لنفوم |
| ایمونولوژی | بررسی جمعیتهای ایمنی |
| پیوند | شمارش و بررسی سلولها |
| سرطانشناسی | بررسی مارکرهای توموری |
| تحقیقات سلولی | چرخه سلولی و آپوپتوز |
| سلولهای بنیادی | شناسایی و جداسازی سلول |
| میکروبشناسی | آنالیز برخی میکروارگانیسمها |
وکتور چگونه میتواند در راهاندازی بخش فلوسایتومتری کمک کند؟
راهاندازی بخش فلوسایتومتری تنها به خرید دستگاه محدود نمیشود و تجهیزات و مواد متعددی باید متناسب با کاربرد آزمایشگاه انتخاب شوند.
افزایش تعداد مارکرها همیشه به معنای بهتر شدن نتیجه نیست. پنل باید بر اساس سؤال بالینی یا تحقیقاتی طراحی شود و همپوشانی طیفی فلوروکرومها در نظر گرفته شود.
نمونههای قدیمی، سلولهای تخریبشده یا نمونههای دارای لخته میتوانند الگوی FSC و SSC را تغییر داده و اعتبار نتایج را کاهش دهند.
در بیماریهای خونی، تفسیر فقط بر اساس مثبت یا منفی بودن یک مارکر کافی نیست و باید الگوی کلی بیان، شدت مارکرها، جمعیت سلولی و یافتههای مورفولوژیک در کنار هم بررسی شوند.
برندهای مطرح تجهیزات فلوسایتومتری
- BD Biosciences
- Beckman Coulter
- Cytek Biosciences
- Thermo Fisher Scientific
- Sony Biotechnology
- Bio-Rad
- Miltenyi Biotec
- Sysmex
- BD Biosciences
- BioLegend
- Beckman Coulter
- Thermo Fisher Scientific
- Miltenyi Biotec
- Abcam
- Cell Signaling Technology
- Agilent
- FlowJo
- Kaluza
- FCS Express
- Cytobank
- SpectroFlo
سؤالات متداول
منابع
- Shapiro HM. Practical Flow Cytometry
- Cossarizza A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies
- McKinnon KM. Flow Cytometry: An Overview
- BD Biosciences. Introduction to Flow Cytometry
- Beckman Coulter. Flow Cytometry Principles and Applications
- International Clinical Cytometry Society Guidelines